Российские ученые разработали новый метод тестирования офтальмологических препаратов и имплантатов
Исследователи из МФТИ и Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН впервые представили детальный протокол электрофизиологической «инвентаризации» светочувствительных клеток в трехмерных органоидах сетчатки, выполненной с помощью метода patch-clamp. Эта работа открывает путь к надежному тестированию препаратов для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки, а также приближает создание бионических имплантатов, способных «разговаривать» на языке живых фоторецепторов.
Сетчатка — это тонкий слой светочувствительных клеток, покрывающий изнутри дно глазного яблока. Именно она преобразует свет в нервные импульсы для формирования изображения. Сетчатка состоит из фоторецепторов: палочек и колбочек, которые работают как живые детекторы света, но их сигналы принципиально отличаются от привычных нервных импульсов.
Изучать процессы, запускающие работу сетчатки глаза человека, чрезвычайно трудно. И здесь на помощь ученым приходят органоиды — трехмерные органотипичные структуры, искусственно выращенные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
«Органоиды активно применяются в медицинских исследованиях. В нашем случае их получают с помощью генетического перепрограммирования: клетки крови человека репрограммируют обратно в эмбриональное состояние и получают индуцированные стволовые клетки. Затем путем дифференцировки направляют их к переходу в клетки сетчатки глаза. В итоге клетки проходят стадии развития, очень похожие на эмбриональные, и через полгода органоиды обзаводятся слоями, содержащими настоящие фоторецепторы с наружными сегментами — теми самыми палочками, которые захватывают свет. Это высокоточная копия дает нам максимальные возможности для тестирования лекарств, проверки промоторов, изучения химических процессов и так далее», — рассказал первый автор статьи, руководитель группы генной терапии ретинопатии, научный сотрудник лаборатории геномной инженерии МФТИ Алсаллум Алмакдад.
Получение органоидов включает три ключевых этапа созревания: ранний (80–110 дней культивации), средний (130 дней) и поздний (150 дней и более). На каждом этапе должен появиться определенный вид клеток. Например, в ранней стадии в сетчатке образуются ганглионарные клетки, в средней стадии — фоторецепторы, а в поздней — биполярные клетки. Важно отследить своевременное появление этих клеток, а также проверить, что искусственно созданные ткани действительно похожи на свои природные аналоги по составу и электрической «начинке».
«Непосредственное отслеживание динамики появления определенных клеток дает нам понимание, что наши органоиды дифференцируются в верном направлении. В этом случае пользуются окрашиванием — иммунофлуоресцентностью, подсвечивая наличие определенных маркеров или генов. Но верный состав еще не все. Мы должны доказать идентичность нашего органоида и со стороны физиологии. И это самое сложное. В мире этим вопросом занимаются только несколько лабораторий. В России мы первые применили метод patch-clamp на органоидах, чтобы точно доказать, что полученные фоторецепторы действительно похожи на природные», — добавил Алсаллум Алмакдад.
Patch-clamp (метод локальной фиксации потенциала) — это электрофизиологический метод, позволяющий измерить потенциал движения ионов в клетке. Каждый канал фоторецепторов отвечает на конкретные ионы: калия, натрия, кальция и других. Измерение потенциала движения дает возможность проверить как наличие этих каналов, так и активность их работы.
Применяя метод patch-clamp, исследователи смогли не только измерить электрические потенциалы и ионные токи нейронов, но и точно идентифицировать заданные клетки с помощью флуоресцентного окрашивания. Кроме того, они построили кривые зависимости тока от напряжения, которые практически совпали с полученными на фоторецепторах млекопитающих.
«Раньше многие коллеги сталкивались с проблемой: органоид дает слабый или противоречивый электрофизиологический ответ, и нельзя быть уверенным, записали вы именно фоторецептор или соседнюю ганглиозную клетку. Наш подход выводит исследователей на новый уровень достоверности: мы можем не только сказать «эти клетки похожи на фоторецепторы», но и показать их электрический паспорт. Также в ходе экспериментов нам удалось зафиксировать развитие тока на разных этапах. У 80-дневных органоидов он еще очень слаб, к 130 дням становится отчетливым, а после 150 суток достигает значений, сравнимых с клетками взрослых приматов. Это вполне объективный критерий функционального созревания», — заключил Алсаллум Алмакдад.
По словам ученых, электрофизиологическая характеристика дает количественную оценку того, восстанавливают ли новые молекулы функцию светочувствительных клеток. Кроме того, разработка бионических протезов сетчатки наталкивается на проблему интерфейса: искусственные электроды должны стимулировать ганглиозные клетки, но было бы идеально «говорить» напрямую с фоторецепторами, если они еще живы. Знание их вольт-амперных характеристик и порогов возбудимости позволяет создавать более эффективные и щадящие стимуляторы.
В ближайшей перспективе ученые планируют применить описанный протокол для анализа синаптической передачи между фоторецепторами и биполярными клетками — следующими нейронами в цепи сетчатки. Для этого потребуется одновременная запись от двух или трех клеток. Другое направление — использование метода patch-clamp в сочетании с оптогенетикой: ввести в органоид ген светочувствительного канала, активируемого определенным цветом, и измерить, как это меняет электрические ответы.